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シカジーニアス® 病原遺伝子検出PCRキット(下痢原性大腸菌用)

下痢原性大腸菌(Diarheagenic E. coli)は、ヒトに腹痛・下痢症を引き起こす大腸菌の総称であり、性質や症状の違いにより、7種類に分類されます。
本キットは、マルチプレックスPCRで遺伝子増幅を行い、その増幅産物を確認することで、日本で主に報告されている5種類の病原遺伝子の保有状況を確認できます。

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特長

●3種類のプライマーミックスを用いて、腸管病原性大腸菌(EPEC)、腸管出血性大腸菌(EHEC)、腸管毒素性大腸菌(ETEC)、腸管侵入性大腸菌(EIEC)、腸管凝集性大腸菌(EAEC)の病原性に関わる遺伝子を検出可能
●検出結果を数値化にすることで、容易に判定可能

キット構成

 個別名称容量数量
試薬A AptaTaq DNA Master(5×Conc.)* 1.2 mL 1 本
試薬B PCRサプリメント 1.1 mL 1 本
試薬C プライマーミックス1 0.4 mL 1 本
試薬D プライマーミックス2 0.4 mL 1 本
試薬E プライマーミックス3 0.4 mL 1 本
試薬F ポジティブコントロール 0.4 mL 1 本
試薬G 6×ローディングバッファー(BPB・XC) 1.2 mL 1 本

*AptaTaq DNA Master(5×Conc.)は、Roche Diagnostics K.K.の商品です。

操作手順

増菌・分離培養 大腸菌を単離する
DNA抽出 シカジーニアス® DNA抽出試薬を用いてテンプレートDNAを調製する
PCR 3種類のマルチプレックスPCRを行う
電気泳動 3%アガロースゲル電気泳動を行う
検出 臭化エチジウム溶液で検出し、PCR断片を検出する
判定 専用の計算シートに結果を入力し、病原型の判定を行う

解析方法

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電気泳動のパターン

100 : 100 bp DNAラダー
P:ポジティブコントロール
1:ATCC® 35150(EHEC)
2:ATCC® 43887(EPEC)
3:ATCC® 35401(ETEC)
4:ATCC® 43893(EIEC)
5:ATCC® 25922(非病原性大腸菌)
6~10:臨床分離株

泳動条件は、3%アガロースKANTO HC(1×TBE緩衝液)で、Mupid-exUを用いて、100 Vで35分間としました。13穴のコームを用い、サンプルを8 μLアプライし泳動しました。
*使用したアガロースゲルは、一枚のゲルに13穴コームを3つ刺して作成しております。



サンプル番号
12345678910
係数の合計値 97 1 24 4 0 97 1 24 16 2
病原型の判定 EHEC EPEC ETEC EIEC その他 EHEC EPEC ETEC ETEC EAEC

検出遺伝子とそのPCR増幅産物サイズ

 係数増幅サイズ(bp)ターゲット領域

Reaction
mixture 1
1 384 eaeA
32 132 stx1
64 93 stx2
Reaction
mixture 2
16 130 est
8 62 elt
Reaction
mixture 3
2 575 aggR
4 382 invE
インターナル
コントロール
120 16s rDNA

InvE遺伝子は、プラスミド上にある侵入性遺伝子のため、脱落する場合があります。
①3つのマルチプレックスPCRの電気泳動結果からバンドパターンを読み取ります。
②この電気泳動のバンドの有無の結果を用いて、解析用エクセルシートに二進法で入力し、病原型の判定を行います。
③16s rDNAが陽性の場合、大腸菌であることが推定できます。

合計ポイントと下痢原性大腸菌の病原型

合計ポイント病原型
0 EHEC/STEC、EPEC、ETEC、EIEC、EAEC以外の大腸菌または近縁の微生物
1 EPEC
2 EAEC
4~7 EIEC
8~11 ETEC(elt+)
16~19 ETEC(est+)
24~27 ETEC(est+、elt+)
32~35 EHEC/STEC(stx1+)
64~67 EHEC/STEC(stx2+)
96~99 EHEC/STEC(stx1+、stx2+)
上記以外 混合感染が疑われる

*EIECと赤痢菌を区別することはできません。合計ポイントが36の場合、志賀赤痢菌の可能性が疑われます。
*stx2(志賀毒素
2型産生遺伝子)は、バリアントによって検出できない場合があります。例)stx2f

製品一覧

製品番号 製品名 保存温度 規格 包装 価格
08178-96 シカジーニアスR DNA抽出試薬
Cica geneusR DNA extraction reagent
冷蔵 分子生物学用 1pack(120回分) ¥22,000
08087-96 シカジーニアスR 病原遺伝子検出PCRキット(下痢原性大腸菌用)
Cica geneusR Pathogenesis Gene Detection PCR Kit (for Diarrheagenic E.coli)
冷凍 分子生物学用 1pack(100回分) ¥85,000

他メーカーの商品に関するライセンス・パテントについては、各メーカーにご確認ください。

・「法律」,「SDS」,「在庫」など詳細情報は、製品番号をクリックいただきご確認いただけます。
・試薬のご購入とご使用に際して

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・「法律」,「SDS」,「在庫」など詳細情報は、製品番号をクリックいただきご確認いただけます。
・試薬のご購入とご使用に際して

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10×TBE Buffer
電気泳動用 1L ¥5,000
49881-60 トリダイ100bp DNAラダー
TriDye 100bp DNA Ladder
冷蔵 125 gel lanes ¥10,000

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パンフレット

シカジーニアス® 病原遺伝子検出PCRキット(下痢原性大腸菌用)(436KB)

取扱説明書

病原遺伝子検出PCRキット(下痢原性大腸菌用)(390KB)

計算シート(ZIPファイル、エクセル)

解析用エクセルシート

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関連文献

1) 公立大学法人 大阪市立大学、株式会社KALS、株式会社二共刃型工業;「下痢原性大腸菌検出方法」、特許公開2008-283895

2) Ruttler, M.E. at el, Biocell, 30(2): 301-308, 2006
3)Hiroe, A et al, Appl, Environ, Microbiol,78(9): 3177-3184, 2012



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